引言：隨著新冠在全球多數國家爆發，了解全球主要經濟體對新冠檢測體外診斷試劑注冊審評要求的異同是體外診斷試劑企業通向全球市場的第一步，一起來看一下。
自2019年12月新冠肺炎疫情發生到如今全球呈多區域爆發情況下，各國監管機構和IVD企業陸續采取積極措施。為積極應對新冠肺炎疫情，國家藥監局于第一時間啟動應急審批程序。1月20日，器審中心起草《2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術審評要點》，并于2月12日在中心官網率先對外發布。
世界衛生組織（WHO）于1月8日修訂了《緊急使用清單（EUL）程序》（Emergency Use Listing Procedure），并于2月28日發布了《SARS-CoV-2核酸檢測試劑申報要求指南》。
FDA于2月29日發布指南《公共衛生突發事件期間在經CLIA認證可開展高復雜性檢測的實驗室于緊急使用授權（Emergency Use Authorization，EUA）批準之前進行2019新冠疾病診斷檢測的政策》。3月16日，FDA更新了該指南，增加了無需提交EUA的政策和適用生產商的政策。
下文將從幾個方面對中國、美國及WHO上述文件中對新冠核酸檢測試劑的要求進行對比分析。
一、文件適用范圍
器械中心發布的審評要點針對我國IVD生產企業，用于申請產品在境內上市的注冊資料申報。WHO指南面向的是全球企業，目的是幫助制造商提交WHO EUL流程申請，該EUL流程旨在加快公共衛生突發事件期間所需IVD的可用性，并基于安全有效性數據等基本質量要求，協助感興趣的聯合國采購機構和成員國確定在公共衛生突發事件期間使用特定產品的可接受性。WHO提供的通道適用于全球采購，也因此在指南的臨床證據中描述了入組說明書中聲稱的各類人群及各使用地區的樣本。美國FDA指南提供了靈活的加速新冠檢測的方式，對于經CLIA認證可開展高復雜性檢測的實驗室，使用該實驗室開發的試劑，在完成產品驗證后、申請EUA之前（一般不超過申請之前15個工作日），允許開展新冠病毒的臨床樣本檢測。對于州/地區授權的轄區內經CLIA認證可開展高復雜性檢測的實驗室，使用該實驗室開發的試劑檢測樣本，在州/地區政府為檢測結果負責的前提下，可無需向FDA提交EUA的申請。對于商業生產商，在其完成產品驗證后，申請EUA之前（一般不超過申請之前15個工作日），允許銷售試劑給實驗室進行樣本檢測。FDA指南對上述實驗室或生產商開發產品的驗證要求是一致的。
二、質量管理體系
WHO EUL程序包括質量管理體系審查和上市后監管計劃，以及評估產品安全有效的檔案審查。我國應急審批過程中，對申報產品進行技術審評、質量管理體系考核和上市后監管，與WHO要求一致。提交給WHO EUL程序的IVD必須在適當、充分且有效的質量管理體系（QMS）下制造。因此評估申報產品的第一步就是對制造商的QMS文檔進行評估，只有在充分證明申請人是制造商，且有適當的QMS證據和所需的制造能力時，才可繼續審評流程。我國這次應急審批工作與WHO相似，器審中心在收到國家局轉來的應急審批名單后，第一時間與相關企業聯系，了解產品和申請人的QMS情況，確認產品是否在有效的QMS條件下生產。相關省局迅速啟動注冊質量管理體系核查，并將核查進度和結果反饋器審中心。我中心發布的新冠核酸審評要點中，亦強調了“企業應提交在符合質量管理體系的生產環境下生產的試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料”。美國FDA兩版指南則均未提及質量管理體系相關要求。
三、應急審評產品證據
WHO EUL程序中產品檔案要求提交產品描述信息以及安全有效性證據。對申報的新冠試劑，如未進行充分的分析和/或臨床性能研究，亦可接受合理的人工樣本模擬研究，在初步證據可支持產品的安全有效性的情況下，可不進行法規要求的全部研究。我國在應急審評中，亦認可有限性證據，可通過產品上市后作業的形式，對目前有一定安全有效性證據，可基本保證產品質量，但證據尚不完全充分的情況下，批準應急產品上市。FDA EUA簽發需要的有效性證據水平為“可能有效”，低于FDA日常產品批準的“有效”標準。
四、產品質量控制要求
WHO和我國均要求明確申報產品的主要原材料/成分信息，但WHO僅要求簡單描述，而我國要求明確主要原材料的驗證過程和質量控制標準，并將主要原材料的來源和質量控制標準在產品技術要求附錄中載明，以注冊證附件的形式進行固定，以確保產品主要原材料的穩定，使其可持續符合經驗證的性能和質量。另外我國要求建立穩定的企業參考品，用來進行日常生產過程中產品的半成品檢驗和成品檢驗。通過原材料和企業參考品的要求，保證了生產原料、半成品和成品的質量均穩定可控。
我國要求新冠核酸檢測試劑盒中應具備質控體系，包括陰性質控品、陽性質控品和內標，其應參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設備、交叉污染等環節進行合理質量控制，避免檢測過程中的假陰性和假陽性。WHO和FDA均未對試劑盒中的質控體系進行要求。
五、性能要求
1. 核酸（RNA）提取/純化性能
WHO和FDA均未要求研究配套提取試劑的性能。因為新冠病毒屬于RNA病毒，需要進行提取分離得到病毒RNA方可進行逆轉錄和擴增檢測，且采集樣本常為咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等，可能存在病毒載量低、PCR抑制物影響反應進行等問題，所以提取并富集目的核酸，純化去除PCR抑制物尤為重要。我國要求對配合使用的核酸提取/純化試劑的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，并將經驗證的提取試劑在說明書中明確，保證了檢測反應順利進行和反應體系的可控性。但是特殊方法學的產品如實驗設計無核酸提取步驟，在性能驗證充分且符合要求的情況下，也可以獲得批準。
2. 不同區域病毒樣本包容性的驗證
目前已經發現新冠病毒產生了149個突變位點，如檢測試劑引物探針結合位置序列發生突變，可能會影響檢測結果。對此，我國要求在引物、探針設計階段，應通過序列比對和試驗等方式，對病毒進行包容性和特異性（如交叉反應）的評價，選擇最佳的引物探針組合。并且在性能評估中應至少驗證包括具有時間和區域特征性的10個不同來源的病毒樣本，以盡量證明檢測試劑可以覆蓋檢測不同病毒株。FDA僅要求采用計算機進行序列比對分析包容性，未要求通過真實病毒進行試驗驗證。WHO對包容性相關序列分析和試驗驗證均未進行要求。
3. 精密度
精密度是檢測試劑的重要性能，我國明確精密度評價不可僅采用模擬樣本，應包含若干臨床樣本，精密度評價試驗應包含核酸分離/純化步驟，并且設置了各樣本的精密度評價標準。通過明確具體要求，確保精密度驗證的充分性。WHO并未進行上述要求，僅概括性地描述了精密度影響因素和樣本濃度水平。FDA指南未提及精密度的要求。
4. 計量學溯源性
WHO表明目前尚無新冠核酸檢測的國際標準品，一旦建立相關國際標準（IS）或參考物質，應根據已建立的IS或參考物質對試劑進行校準，目前階段，試劑應溯源至經驗證的新冠參考物質（例如，來自國家控制機構的參考物質）。WHO亦要求制造商參加一項合作研究，以評估臨時性IS。這與我國情況基本一致，在審評過程中，我們要求采用科學的方法標定病毒滴度，進行最低檢測限相關的量值研究。中檢院建立了應急用國家參考品，可評估各申報試劑的相對靈敏度。但是中檢院并未對其參考品進行定值，所得結果僅可體現各申報試劑平行比對的信息，無法體現具體的病毒量值。目前我國批準的新冠核酸檢測試劑均為定性檢測試劑。FDA指南未提及量值研究。
5. 最低檢測限
我國和WHO、FDA對最低檢測限研究方法的要求基本一致，均為采用梯度稀釋，多次重復測定獲得具有95%陽性檢出率的濃度水平。但是WHO允許使用體外轉錄或裝甲RNA等模擬樣本進行最低檢測限研究，而未要求必須使用病毒樣本或核酸提取液。FDA指南接受采用RNA或滅活病毒摻入人工基質或真實臨床樣本基質，但是未表示接受體外轉錄或裝甲RNA等模擬被測物。我國要求至少采用不同來源的3個具有代表性的新冠病毒樣本或假病毒和另外3個不同真實臨床樣本或核酸提取液分別進行最低檢測限的確定和驗證，以充分研究最低檢測限這一關鍵性能。
如果適用多種基質樣本類型，FDA推薦在EUA申請中僅提交采用最具挑戰性臨床基質進行的最低檢測限研究結果。例如，若試劑可檢測痰液、支氣管肺泡灌洗液、鼻咽拭子等呼吸道樣本，實驗室應僅提交痰液樣本的最低檢測限結果。我國和WHO均要求，對每種聲稱的樣本類型均應進行最低檢測限研究，相對FDA，我國和WHO該要求更加嚴格。
6. 分析特異性（干擾試驗和交叉反應）
WHO要求對于常規PCR檢測試劑或者測試前使用完善的提取方法的試劑，檢測呼吸道或血漿樣本時可不必進行干擾研究。對于新的提取方法或等溫擴增等非常規PCR產品，需要對潛在的干擾物進行測試。這一點與我國要求不同，因為新冠病毒核酸為RNA，其檢測過程中需要進行逆轉錄和PCR擴增兩個關鍵步驟，逆轉錄酶比普通DNA聚合酶更易受到其他物質干擾，所以為充分發現潛在的干擾物質，我國要求所有試劑均應進行干擾研究。對于推薦的潛在干擾物質，WHO和我國要求基本一致，但是WHO僅描述了干擾物質的類別，而我國對干擾物質類別和具體物質/活性成分均采用表格列舉的方式進行了明確，有利于申請人執行該要求，亦可保持審評尺度一致。對于推薦的交叉反應物質，WHO和我國要求的病原體大部分相同，但亦各自存在一些不同的病原體，這可能與不同地區出現的感染病原體種類不同有關。值得一提的是，我國對于交叉病原體要求明確了種類和具體型別，更加具體，且試驗驗證的病原體種類相對較多，確保了驗證的充分性。
WHO明確了干擾樣本應一式三份進行測試，避免單次檢測帶來的隨機誤差。對于病原體交叉反應研究，建議通過將培養的分離物摻入陰性臨床基質中來制備測試樣品，避免申請人直接采用病原體培養物而忽略樣本基質帶來的影響。在交叉反應研究中，WHO要求包括實驗室測試和計算機分析兩種方法。對于交叉反應可能性較高的病原體，應進行這兩種分析，而對其他可能的交叉反應病原體，可僅進行計算機分析，如果計算機分析發現序列同源性較高等交叉風險，再根據需要進行實驗室測試。這樣可以驗證更多潛在交叉的病原體，而不顯著增加企業的試驗負擔。另外對于計算機分析表明與測試引物/探針同源性較高的微生物，應進行干擾研究，驗證高水平干擾病原體存在的情況下，是否對弱陽性新冠樣本的檢測產生干擾。這些要求均值得我們借鑒。
FDA指南中未提及干擾試驗，僅對交叉反應進行了要求。FDA認為計算機分析引物探針與常見呼吸道菌群及其他病毒等病原體的序列同源性對最初的臨床應用是充分的。另外，FDA推薦實驗室應遵循公認的實驗室程序，對待測樣本類型的其他交叉反應進行測試。相比之下，FDA對特異性的要求最為簡單和概括。
7. 適用機型
由于新冠核酸檢測試劑需要采用實時熒光定量PCR儀進行檢測，不同廠家和型號的儀器存在差異，可能會導致檢測條件和擴增效率不同。所以，我國要求對于適用多個機型的試劑，應提供產品說明書【適用機型】項中列出的所有型號儀器的性能評估資料。WHO和FDA對性能評估的要求均未考慮機型因素,FDA可能考慮適用儀器一般是封閉系統，所以未提及。
8. 樣本類型
WHO要求每種樣本類型（例如不同的拭子類型或病毒轉運介質等）應進行基質等效性研究，最低檢出限和臨床特異性研究。我中心審評要點規定“不同樣本類型應分別進行性能評估驗證。”該要求較WHO要求更加嚴格。但是一般我們要求的不同樣本類型為咽拭子、痰液和肺泡灌洗液等。在考慮最小負擔原則的前提下，我們并未要求不同的拭子及轉運介質均進行全性能評估。FDA指南并未考慮不同樣本類型和基質的驗證，僅在最低檢測限研究中表示應采用最具挑戰性臨床基質進行試驗。
9. 陽性判斷值
陽性判斷值即指通過試劑檢測結果判斷是否存在病毒核酸的臨界Ct值，是結果判斷的依據，陽性判斷值設置的合適與否，直接關系到是否會出現假陽性和假陰性，我國要求提交陽性判斷值確定資料，并對該研究提出了具體的要求。WHO和FDA均未要求提交該資料。
10. 樣本穩定性
WHO要求在每種條件下，應至少測試10個樣本的穩定性。因為考慮樣本穩定性屬共性特征，與樣本例數關系不大，我國并未要求樣本穩定性研究的例數。
11. 試劑穩定性
WHO和我國均要求進行試劑穩定性研究，并且在時間有限的情況下，可提交未完成的實時穩定性試驗資料，資料中應包含研究計劃和當前的研究結果。企業應在產品上市后繼續完成實時穩定性研究。
12. 主要生產工藝及反應體系的研究資料
我國需提交產品的主要生產工藝確定的研究資料，同時提供反應體系的詳細研究資料，評價產品生產和使用過程的科學性，WHO和FDA均未要求提交該資料。
13. 測試能力
WHO要求提交測試能力相關資料，描述申報產品的樣本通量/容量，執行測試所需的時間（從臨床樣本采集到獲得檢測結果）以及每臺儀器每天可進行的測試次數。我中心在與企業溝通中均會了解產品測試通量和速度等信息，但是未將該內容寫入審評要點，未將其作為申報資料的一部分進行提交。在疫情防控的緊急狀態下，將審評資源集中在通量高、速度快、易于推廣應用的產品上，是更加科學高效的選擇。
六、臨床試驗要求
1. 臨床試驗機構
WHO表示臨床試驗可未完成，但是必須具有部分臨床證據以確認臨床性能。WHO和FDA均未對臨床試驗機構進行要求。我國要求在三家以上臨床試驗機構進行臨床試驗。如臨床試驗機構條件允許，推薦多家生產企業的試劑盒在相同的臨床試驗機構共同驗證。
2. 臨床樣本要求
WHO要求納入各使用地區的樣本，理想情況下應進行50個前瞻性陽性樣本研究，如前瞻性研究難以實現，亦可接受回顧性研究。至少檢測25個真實的臨床陽性樣本（前瞻性和回顧性），其余樣本可以是向陰性臨床基質中添加新冠病毒制作的人工樣本，臨床特異性評價需要收集有癥狀個體的至少100份陰性標本。FDA考慮陽性樣本難以獲取，推薦實驗室通過一系列人工樣本來確認臨床性能，要求至少檢測30個反應性人工樣本和30個非反應性樣本，反應性人工樣本可以通過將RNA或滅活病毒摻入剩余臨床樣本中制備。對于CLIA認證實驗室開發試劑，在等待EUA申請結果的同時，FDA建議實驗室采用一個經EUA授權的方法，對申報試劑檢測的前5個陽性和前5個陰性臨床樣本的結果進行確認。我國建議入組確診病例不少于200例，排除病例不少于300例，可為臨床樣本或者經提取后的核酸提取液。可見我國要求的臨床試驗例數更多且均要求真實臨床樣本，所獲得的臨床證據更加真實和充分。WHO和FDA對制備的人工樣本濃度均進行了要求，應有較高比例的檢出限濃度樣本，同時具備覆蓋檢測范圍的樣本。由于我國要求臨床試驗均采用真實臨床樣本，所以無法精確配制具體濃度，主要通過覆蓋各類適用人群，實現樣本濃度的多樣性。
3. 臨床試驗入組人群
WHO要求納入說明書聲稱的各類人群，但是未具體描述適用人群的概念和范圍。我國明確了適用人群為新冠肺炎疑似病例，要求入組確診和排除病例，包括部分前期核酸檢測陰性的確診病例，解除隔離和符合出院標準的病例，入組病例中不同臨床嚴重程度、不同病程階段的患者均應有一定的例數。可見我國要求的臨床試驗入組人群更加具體和全面，覆蓋了產品在實際臨床應用中的所有情況。FDA指南未對臨床評價入組人群進行要求。
4. 臨床試驗對比方法
WHO推薦的對比方法是：對于臨床樣本，和FDA EUA或WHO EUL 列出的PCR檢測進行對比；對于人工樣本，與預期結果進行比較。FDA要求的臨床證據包括人工樣本和CLIA認證實驗室在等待EUA申請結果時檢測的10個臨床樣本（檢測的前5個陽性和前5個陰性臨床樣本）。其中人工樣本與制備的預期結果進行比較，臨床樣本采用一個經EUA授權的方法，對檢測結果進行確認，如果任何一個結果不符，實驗室應通知FDA，并且采取其他合適的措施，例如終止檢測患者樣本，并發布聲稱之前檢測結果可能無效的更正測試報告。我國要求臨床試驗應選擇已上市的同類產品作為對比產品，同時，考慮考核試劑檢測結果與臨床確診/排除結果進行對比。其中臨床確診病例應依據衛健委發布文件的新冠感染病例確認程序判定，不建議采用某一試驗地點的單次試驗結果作為確認結果。可見我國要求的臨床試驗對比方法綜合對比試劑和完整的感染病例確認程序，結果更加準確。
5. 臨床試驗結果的統計分析
WHO和FDA對臨床結果的統計分析，僅要求計算一致性百分比。我國要求的統計分析對結果數據的挖掘更加充分，具體分析內容包括：符合率、臨床靈敏度、臨床特異度及其置信區間，人口學分析，不同人群的分層統計，不同樣本類型的分別分析以及不一致結果的分析。
七、總結
綜上可以發現，我國對新冠核酸檢測試劑的要求比較充分和明確，在疫情防控的應急狀態下，我們接受有限的證據，但在可實現的情況下，要求安全有效性證據盡量充分。并且通過審評要點明確具體要求，利于申請人在產品驗證確認過程中一步到位，不走彎路，同時有利于保持審評尺度的一致性。同時，我們也注意到，國際監管機構存在部分先進經驗，值得我們學習和借鑒。
標簽：體外診斷試劑注冊、醫療器械臨床試驗